Los nuevos métodos de detección e identificación de patógenos microbianos, basados en el ADN, ofrecen ventajas tanto para los productores como para los consumidores. La seguridad microbiológica de los alimentos continúa suscitando gran preocupación entre todos los componentes de la cadena alimentaria, del campo a la mesa.

Productores, transformadores y encargados de la elaboración de alimentos toman todas las precauciones posibles para evitar que la comida que ofrecen pueda provocar una intoxicación. Entre los sistemas para la gestión de la seguridad alimentaria que han demostrado ya resultados satisfactorios cabe mencionar el sistema de Buenas Prácticas de Fabricación y el denominado Análisis de Riesgos y Control de Puntos Críticos. Un aspecto importante de estos sistemas preventivos que garantizan la seguridad, es que determinan si los patógenos en potencia se encuentran en los productos en crudo o en el entorno de la cadena de producción alimentaria en cuestión.

Tiempo y precisión

Las pruebas de detección de agentes patógenos siempre han requerido largos análisis a cargo de personal muy cualificado. En la última década, esos análisis tradicionales se han sustituido por métodos que se sirven del ADN, mucho más rápidos. Un técnico puede realizarlos en cuestión de pocas horas, mientras que las técnicas antiguas podían llevarle varios días a un microbiólogo altamente preparado. Estos nuevos métodos, al utilizar información genética para detectar las bacterias, proporcionan resultados más precisos que los tradicionales, basados en las características bioquímicas e inmunológicas, que estaban sujetos a las condiciones del entorno.

Tanto de tan poco

Muchos de los nuevos métodos dependen de la ampliación enzimática o reacción en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction, PCR), que ha revolucionado en los últimos años gran parte de la biología molecular, ya que permite obtener cantidades considerables de ADN a partir de muestras ínfimas. Otros se basan en una técnica denominada hibridación del ADN. Los primeros resultan de gran utilidad para confirmar la presencia o ausencia de agentes patógenos determinados en los alimentos. Para comprobar la existencia de un germen en particular, como la bacteria de la salmonela, se toma una muestra del alimento en cuestión y se favorece el desarrollo de cualquier bacteria en él. Se extrae luego el ADN de las bacterias y, mediante la técnica de PCR, se amplifican las pequeñas cantidades de ADN extraídas hasta obtener cantidades fáciles de identificar. La PCR sólo amplificará el ADN del organismo elegido (en este caso, la salmonela) y, de estar presente, resultará fácil de detectar. Diversos métodos de producción comercial para toda una serie de bacterias patógenas están ya disponibles.

En busca de la pareja ideal

Cuando se trata de identificar de forma precisa ciertos patógenos en materias primas, a lo largo de la cadena de producción o en los productos finales, se aplican técnicas basadas en la hibridación del ADN, que proporcionan las "huellas" del ADN de los microbios. Existe una versión automatizada de este sistema, que compara la huella del ADN de cualquier muestra con otras almacenadas en una base de datos y archiva luego el prototipo, así como las referencias relativas a su origen.

Al cotejar esas huellas características a través de todo el proceso de producción alimentaria, se puede establecer el origen del agente patógeno. A modo de ejemplo, una empresa del sector alimentario detectó recientemente el Estafilococo de la epidermis en sus productos mediante los procedimientos de garantía de calidad habituales. La tecnología reciente permitió descubrir que, de entre las diversas fuentes posibles de dicho espécimen patógeno en la planta de producción, el origen de la contaminación eran las manos de un empleado, con lo que pudieron tomarse medidas correctivas inmediatas y de bajo coste, en lugar de verse forzados a suspender la actividad para realizar una costosísima descontaminación general.

Gracias a estos nuevos métodos novedosos basados en el ADN, se puede identificar rápidamente el origen de patógenos y retirar de la venta los alimentos afectados. Es indudable que tanto los productores como los consumidores se benefician de estas técnicas, que permiten llevarles la delantera a los agentes patógenos.

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Fuente: www.eufic.org

Cuando esterilizar no es limpieza suficiente

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Los procesos de centrifugado

Existen dos métodos de separación en centrifugación:

A.- Centrifugación diferencial.
B.- Centrifugación en gradiente de densidad.

Coeficiente de sedimentación (s)

La velocidad de sedimentación de una partícula depende del campo centrífugo aplicado. Es un parámetro útil para caracterizar una partícula y puede ser determinada en una ultracentrífuga.

Se define coeficiente de sedimentación (s) como la velocidad de sedimentación por unidad de fuerza centrífuga. Ésta depende de la masa y densidad de la partícula; de la densidad del medio y del coeficiente de fricción, que depende a su vez de la forma de la partícula. El coeficiente de sedimentación(s) es directamente proporcional a la masa de la partícula (m) e inversamente proporcional al coeficiente de fricción (f) de la misma.

S α m/f

La unidad se denomina Svedberg, (S)

1 S= 10-13 seg., en H2O a 20 ºC

La centrifugación diferencial

En este método, el tubo de centrífuga se llena con una mezcla uniforme problema. Tras la centrifugación se obtienen dos fracciones: un pellet que contiene el material sedimentado y un sobrenadante con el material no sedimentado. Es una técnica muy útil, sobre todo para aislamiento de células y orgánulos subcelulares. Es un tipo de separación logrado en base al tamaño de las partículas.

Esta técnica consiste en someter a una muestra heterogénea de partículas a fuerzas de centrifugación crecientes por períodos de tiempo crecientes. Los precipitados obtenidos luego de cada centrifugación estarán enriquecidos en una determinada partícula.

Para lograr la separación, los coeficientes de sedimentación de las partículas deben diferir en al menos un factor de tres (moléculas con s mayores precipitan primero).

La centrifugación en gradiente de densidad

El método de gradiente de densidad implica la utilización de un soporte fluido, cuya densidad aumenta desde la zona superior a la inferior. El gradiente se consigue con un soluto preferiblemente de baja masa molecular en un solvente en el que la muestra a analizar pueda ser suspendida. La muestra se sitúa en la parte superior del gradiente como una fina banda. La separación de los componentes de la muestra se presenta como diferentes bandas o zonas. Existen dos variaciones dentro de la centrifugación en gradiente de densidad:

Estas técnicas permiten la separación de partículas y moléculas que difieren en masa o densidad.

La centrifugación de equilibrio en gradiente o isopícnica

La centrifugación de equilibrio en gradiente separa las partículas con base en sus densidades diferentes. En esta técnica la muestra es disuelta en una solución isocrática y bajo la fuerza centrífuga el soluto forma el gradiente al distribuirse en el tubo durante la centrifugación, se denominan autoformados. La condición fundamental es que la densidad máxima del gradiente final debe siempre exceder a la densidad de las partículas. La centrifugación de equilibrio en gradiente permite que las especies sedimentantes se muevan por el gradiente hasta que alcanzan un punto donde su densidad y la del gradiente son idénticas, por lo cual también se le llama centrifugación isopícnica. En este punto no se producirá una sedimentación posterior debido a que flotan sobre un "colchón" de material que posee una densidad superior que la suya propia de tal manera que aunque se prolongue el tiempo de centrifugación, las partículas no van a ir al fondo del tubo. La densidad de la partícula en ese punto se conoce como “buoyant density”. Esta técnica se emplea para separar partículas similares en tamaño pero distintas en densidad. Esto es cierto para moléculas, tales como ácidos nucleícos, así como diferentes orgánulos celulares.

Se requieren las siguientes características en los solutos usados para formar el gradiente: bajo PM (de manera que el tiempo requerido para lograr el equilibrio sea corto), bajo grado de ionización, baja viscosidad y alta densidad, transparencia a la luz UV, y ser buen solvente para las moléculas que se intentan resolver. Frecuentemente se usa CsCl, el Cs+, por ser un ión compacto, sedimenta lentamente en los altos campos gravitacionales aplicados durante la centrifugación y se establece un gradiente con la mayor concentración en el fondo del tubo (el ión Cl- lo sigue de manera de mantener la neutralidad de las cargas). Por otro lado el Cs+ se une a los fosfatos del DNA y RNA y a los grupos OH- de las ribosas de manera que la densidad de las moléculas de RNA se incrementa más que la del DNA. La densidad aproximada en CsCl de proteínas es 1.3 g/ml; del DNA 1.6 - 1.7 g/ml y del RNA es 1.75 - 1.85 g/ml. Los gradientes de CsCl permiten separar moléculas cuyas densidades difieren en por lo menos 0.02 g/ml.

En los medios de separación suelen incluirse también Hg++ o Ag+, con el propósito de aumentar las diferencias entre las densidades de las moléculas (a pH neutro el Hg++ se une a T y A, y el ión Ag+ se une a G y C). El agregado de compuestos intercalantes como el bromuro de etidio permiten separar moléculas de DNA de distinta conformación aunque tengan la misma composición de bases.

Moléculas con una alta proporción de G y C poseen mayor densidad como consecuencia de los tres puentes H formados.

La siguiente ecuación relaciona el % de G+C con la densidad (?) de la molécula:

% (G+C)= [(?- 1.66)/0.098] 100

La centrifugación zonal

La muestra a analizar se deposita en la parte superior de un gradiente de densidad preformado. Bajo fuerza centrífuga las partículas comenzarán a sedimentar a través del gradiente, moviéndose cada partícula a diferentes velocidades dependiendo de su masa. La migración depende de: el tamaño y forma de las partículas, la fuerza centrífuga aplicada, y la densidad y viscosidad del medio. La propiedad física sobre la que se fundamenta la separación es la masa de las partículas, y no su densidad. A diferencia de lo que ocurre en la centrifugación isopícnica, la densidad máxima del gradiente no debe exceder la de las partículas a separar. Los gradientes de densidad impiden que las bandas de cada componente se ensanchen por efecto de corrientes convectivas y se mezclen durante la aceleración y desaceleración del rotor. Frecuentemente se usan con este propósito gradientes de sacarosa, más densos en el fondo que en la parte superior del tubo; otros medios usados con este fin son: glicerol, Ficoll, Percoll. En general se usan rotores de tipo swing-out. Las muestras son centrifugadas lo suficiente como para separar las moléculas de interés; si la centrifugación se prolonga en el tiempo las partículas se recuperan en el pellet, como se muestra en el siguiente gráfico:

Diagrama de representación de la velocidad de la centrifugación zonal e isopicnica
ρ1: Densidad boyante de partículas de menos densidad
ρ2: Densidad boyante de partículas de más densidad

Con la finalidad de obtener separaciones adecuadas de los componentes de las mezclas es necesario que la velocidad y el tiempo de centrifugado sea el adecuado para lo cual el equipo en el cual se llevará a cabo el proceso deberá estar debidamente calibrado, en cuanto a revoluciones por minuto y a tiempo de centrifugado, para lo cual Instrumentos Científicos y de Laboratorio (ICLAB), cuenta con personal calificado para verificar y calibrar este tipo de equipos

Instrumentos Científicos y de Laboratorio S. A. de C. V., (ICLAB), es una empresa con la misión de proporcionar servicios de calibración y calificación de la más alta calidad a equipos e instrumentos, cumpliendo con los requerimientos de normas y recomendaciones nacionales e internacionales.

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