Prueba de esterilidad I

Medios de cultivo y soluciones

La prueba de esterilidad tiene fundamento en la detección de formas viables de microorganismos, en medios de cultivo adecuados para el crecimiento de bacterias, hongos y levaduras que se encuentran como contaminantes en productos estériles.

Recomendaciones especiales para la prueba de esterilidad

Para evitar una contaminación accidental la prueba debe llevarse a cabo en condiciones asépticas por lo que periódicamente se realizará el control ambiental de las áreas de trabajo, así como del equipo y material empleados. Los envases de las muestras deben desinfectarse previamente a su análisis. A los  productos envasados al vació, se les debe introducir aire filtrado a través de algodón estéril. Si el producto tiene diluyente o algún aplicador anexo, también debe cumplir la prueba de esterilidad. Se debe llevar a cabo una prueba en blanco como testigo, paralela a los análisis de las muestras.

Pruebas de esterilidad en medios de cultivo y soluciones

Prepararlos medios de cultivo a partir de medios deshidratados comerciales o preparados en base a sus formulaciones. Ajustar el pH con soluciones 1N de hidróxido de sodio ó 1N de ácido clorhídrico para que después de esterilizar en autoclave se obtenga el valor indicado en cada caso. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos.

Medio A. Medio fluido de cioglicolato

Mezclar los ingredientes hasta que estén completamente disueltos en agua, calentar si es necesario. Ajustar el pH, calentar nuevamente sin hervir y filtrar a través de papel filtro humedecido. Añadir la solución de resarsurina de sodio y envasar en tubos adecuados. Esterilizar. El medio presenta coloración rosa superficial por la oxidación del mismo, la cual no debe rebasar la tercera parte del volumen total; si la coloración es mayor, se puede calentar una vez en baño de agua hasta que la coloración desaparezca. Usarse cuando la coloración se reestablezca a la décima parte del volumen total del medio.

Medio B. Medio fluido de tioglicolato con  polisorbato 80

Preparar el medio como lo realiza para el medio A adicionar por cada litro de medio 50mL de polisorbato 80. Esterilizar.

Medio C. Medio Fluido de tioglicolato con penicilanasa

Preparar el medio como se indica en el medio A. A cada tubo de medio estéril  adicionar suficiente penicilinasa estéril para inactivar la penicilina presenten la muestra.

Medio D. Medio fluido de tioglicolato con polisorbato 80 adicionado de penicilinasa

Preparar el medio como indica medio B. A cada tubo con medio estéril, adicionar suficiente penicilinasa para inactivar la penicilina presente en la muestra.

Medio E. Caldo soya tripticaseína

Disolver los ingredientes en 500mL de agua, calentando suavemente hasta que la disolución sea completa  y llevar ala aforo a 1000mL. Ajustar el pH, filtrar y envasar en tubos adecuados. Esterilizar.

Medio F. Caldo soya tripticaseína con polisorbato 80

Preparar el medio como se indica en el medio E. Adicionar 5 ml de polisorbato 80 por cada litro de medio.

Medio G. Caldo soya tripticaseína con penicilinasa

Preparar el medio como se indica en Medio E. Adicionar la cantidad suficiente de penicilinasa para inactivar la penicilina presente en la muestra.
Medio H. Caldo soya tripticaseína con polisorbato 80 adicionado de penicilinasa.
Preparar el medio como se indica en medio F. A cada tubo con medio estéril adicionar suficiente penicilinasa estéril para inactivar la penicilina presente en la muestra.

Solución I. Solución al 1% de peptona

Disolver un gramo de digerido péptico de tejido animal en 1000mL de agua destilada, filtrar y ajustar el pH a 7.1±0.2, Distribuir en envases conteniendo 100mL cada uno y esterilizar.

Solución II. Solución al 1% de peptona con polisorbato 80

Preparar la solución como se indica en I. Agregar 1mL de polisorbato 80 por cada litro de solución. Envasar y esterilizar.

Solución III. Solución al 0.85% de cloruro de sodio

Disolver 8.5g de cloruro de sodio en agua destilada y llevar al aforo a 1000mL; distribuir en envases conteniendo 100mL cada uno y esterilizar.

Solución IV. Solución de peptona y extracto de carne con polisorbato 80

Disolver los ingredientes en agua destilada, llevar al aforo a 1000mL, ajustar el pH, envasar y esterilizar.

Solución V. Solución de penicilinasa

Preparar la solución de penicilinasa y valorarla en unidades Levy. Esterilizar la solución de penicilinasa por filtración a través de membrana.

Solución VI. Meristato de isopropilo

Utilizar meristato de isopropilo esterilizado por filtración a través de membrana con pH del extracto acuoso de 5.5 o mayor. Determinar el pH del extracto acuoso y envasar en frascos estériles.

Como se puede observar es crítico que los medios estén estériles, lo que se hace mediante esterilización por calor húmedo en la mayoría de los casos, razón por la cual la autoclave debe estar funcionando correctamente, en ICLAB contamos con personal calificado y apto para realizar pruebas de calibración, ajuste y validación de esterilización por éste método.

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Jarabes simples, saturados

Debido a su predominio como vehículos de la solución, consideraremos algunas de las calidades especiales de jarabes. Un jarabe es una solución concentrada o casi saturada de sacarosa en agua. Un jarabe simple contiene solamente sacarosa y agua purificada (por ejemplo jarabe USP). Los jarabes que contienen las sustancias de sabor agradable se conocen como jarabes saborizantes (por ejemplo jarabe de cereza, jarabe de acacia, etc. ). Los jarabes medicinales son aquéllos a los que se les han agregado compuestos terapéuticos ( por ejemplo jarabe de Guaifenesin).

El jarabe, USP contiene 850 g de sacarosa y 450 ml de agua en cada litro de jarabe. Aunque muy concentrada, la solución no es saturada. Dado que 1 g de sacarosa se disuelve en 0.5 ml de agua, sólo 425 ml de agua serían suficientes para disolver 850 g de sacarosa. Este leve exceso de agua realza la estabilidad del jarabe sobre una gama de temperaturas, permitiendo la conservación en cámara frigorífica sin la cristalización.

La alta solubilidad de la sacarosa indica un alto grado de hidratación o de puentes de hidrógeno entre la sacarosa y el agua. Esta asociación limita la asociación posterior entre el agua y los solutos adicionales. Por lo tanto, los jarabes tienen un poder solvente menor y esto puede ser un problema.

PRESERVACIÓN DE JARABES
El jarabe USP se encuentra protegido contra la contaminación bacteriana en virtud de su alta concentración del soluto. Sin embargo, jarabes más diluidos constituyen buenos medios para el crecimiento microbiano y requieren la adición de conservadores. Los jarabes industriales formulados contienen a menudo ingredientes para mejorar la solubilidad, estabilidad, gusto o aspecto y que también contribuyan a la preservación del producto. Es necesario, de un punto de vista económico, considerar la aditividad de los efectos conservadores de ingredientes tales como el alcohol, la glicerina, el propilenglicol y otros sólidos disueltos. El jarabe USP, teniendo una gravedad específica de 1.313 y una concentración de 85% w/v es una solución al 65% w/w. Este 65% en peso es la cantidad mínima de sacarosa que preservará el jarabe neutral. Si uno desea formular un jarabe que contenga menos sacarosa, la cantidad de alcohol u otros conservadores, puede ser estimado considerando el equivalente en jarabe USP y el equivalente en agua libre. Se puede asumir que el agua libre es preservada por 18% de alcohol.

Para calcular el equivalente de agua libre, el volumen ocupado por la sacarosa, el volumen preservado por la sacarosa y el volumen ocupado y/o preservado por otros añadidos, se deben restar del volumen total de la preparación. En jarabe USP, 850 g de sacarosa ocupan un volumen aparente de 550 ml; por lo tanto cada gramo de sacarosa ocupa 550/850 ó bien 0.647 ml. Si 850 g de sacarosa preservan 450 ml de agua, entonces cada gramo de sacarosa preserva 450/850 = 0.53 ml de agua.

Ejercicio:

¿Cuánto alcohol USP se requiere para preservar 1L de jarabe que contiene 500 g de sacarosa?
Volumen preservado por la sacarosa = 500 g x 0.53 ml/g = 265 ml
Volumen ocupado por la sucrose = 500 g x 0.647 ml/g = 324 ml
Equivalente de agua libre = 1000 ml - 265 ml - 324 ml = 411 ml
Volumen de alcohol requerido para preservar el producto: 411 ml x 18% = 74 ml
74 ml de alcohol absoluto ÷ 95% = 78 ml de alcohol USP
Si existen otros sólidos disueltos, se sustrae su volumen (normalmente estimado) del volumen de agua libre. Si hay glicerina presente, su volumen preserva un volumen igual de agua libre. El propilenglicol se considera equivalente al etanol.

PREPARACIÓN DE JARABES
Los jarabes se deben preparar cuidadosamente en equipo limpio para prevenir contaminaciones. Se pueden utilizar tres métodos para preparar jarabes :

· Disolución con calor
· Agitación sin calor
· Percolado

Aunque el método caliente es el más rápido, no es aplicable a jarabes cuyos ingredientes son termolábiles o volátiles. Cuando se emplea calor, la temperatura debe ser controlada cuidadosamente para evitar la descomposición y el oscurecimiento del jarabe (caramelización).

Los jarabes pueden ser preparados con otros azúcares, no sólo con sacarosa (glucosa, fructosa), con polioles no provenientes de azúcares (sorbitol, glicerina, propilenglicol y manitol), o con edulcorantes artificiales no nutritivos (aspartame, sacarina) que se utilizan cuando se requiere una reducción en el contenido calórico o glucogénico, por ejemplo en el caso de enfermos de diabéticos. Los Endulzantes no nutritivos no imparten la viscosidad característica de los jarabes por lo que requieren de la adición de otros ingredientes como metilcelulosa para ajustar la viscosidad. A pesar de que los polioles son menos dulces que la sacarosa, tienen la ventaja de proveer una viscosidad favorable y reducen las probabilidades de que la tapa del frasco de jarabe se “trabe” (cosa que ocurre al cristalizarse la sacarosa) y en algunos casos actúan como co-solventes y conservadores. Existe una solución comercial de sorbitol al 70% que se usa principalmente como vehículo.