¿Qué es Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC)?
La cromatografía es un método físico de separación basado en la distribución de los
componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra móvil.
En la cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que contiene a la fase fija.
La cromatografía líquida “clásica” se lleva a cabo en una columna generalmente de vidrio, la cual está rellena con la fase fija.
Luego de sembrar la muestra en la parte superior, se hace fluir la fase móvil a través de la columna por efecto de la gravedad.
Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamaño de las partículas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamaño de los micrones, lo cual generó la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase móvil. De esta manera, nació la técnica de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), que requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones requeridas.
Dependiendo del tipo de fase fija y del tipo de fenómeno físico que provoca la separación, la cromatografía líquida de alta resolución puede ser:
1. Cromatografía de adsorción.
La fase fija es un sólido y se utiliza casi exclusivamente sílice (sílica) y en mucha menor
medida alúmina.
2. Cromatografía de reparto.
En casi todos los casos, como fase estacionaria se utilizan compuestos unidos químicamente a un soporte sólido de sílica. Se la subdivide encromatografía en fase normal y fase reversa. En la cromatografía en fase normal, la fase fija es polar (como por ejemplo agua o trietilenglicol) y los compuestos menos polares eluyen primero. En la cromatografía en fase reversa, el compuesto unido químicamente es un hidrocarburo alifático y se emplean fases móviles polares. En este caso, las sustancias más polares eluyen primero.
3. Cromatografía iónica.
Se utilizan columnas rellenas con resinas de intercambio iónico para separar y determinar
iones.
4. Cromatografía de exclusión por tamaño.
La fase fija está formada por partículas poliméricas o de sílice que contienen una red uniforme de poros y llevan a cabo un fraccionamiento realcionado con el tamaño molecular.
Las moléculas de tamaño mayor son excluídas y eluyen primero, mientras que las más pequeñas que penetran en los poros son retenidas más tiempo.
El HPLC es una de las técnicas de laboratorio más utilizada como herramienta analítica para separar y detectar compuestos químicos.
Una parte fundamental de los cromatógrafos de HPLC es la bomba.
Las bombas para HPLC deben cumplir ciertos requisitos fundamentales:
- Deben producir presiones estables hasta 6000 psi.
- Deben mantener el flujo libre de pulsaciones
- Deben generar intervalos de caudales de flujo (0,1 a 10 ml/min)
- Deben permitir un control y reproducibilidad del flujo de solvente
- Sus componentes deben ser resistentes a la corrosión
Las bombas que se usan en HPLC se pueden clasificar según su funcionamiento y diseño en:
- Mecánicas
- Recíprocantes
- De desplazamiento contínuo
- Neumáticas
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