¿Qué es Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC)?

La cromatografía es un método físico de separación basado en la distribución de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra móvil. En la cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que contiene a la fase fija.

La cromatografía líquida “clásica” se lleva a cabo en una columna generalmente de vidrio, la cual está rellena con la fase fija. Luego de sembrar la muestra en la parte superior, se hace fluir la fase móvil a través de la columna por efecto de la gravedad.

Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamaño de las partículas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamaño de los micrones, lo cual generó la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase móvil. De esta manera, nació la técnica de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), que requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones requeridas.

Dependiendo del tipo de fase fija y del tipo de fenómeno físico que provoca la separación, la cromatografía líquida de alta resolución puede ser:

1. Cromatografía de adsorción.
La fase fija es un sólido y se utiliza casi exclusivamente sílice (sílica) y en mucha menor medida alúmina.

2. Cromatografía de reparto.
En casi todos los casos, como fase estacionaria se utilizan compuestos unidos químicamente a un soporte sólido de sílica. Se la subdivide encromatografía en fase normal y fase reversa.  En la cromatografía en fase normal, la fase fija es polar (como por ejemplo agua o trietilenglicol) y los compuestos menos polares eluyen primero. En la cromatografía en fase reversa, el compuesto unido químicamente es un hidrocarburo alifático y se emplean fases móviles polares. En este caso, las sustancias más polares eluyen primero.

3. Cromatografía iónica.
Se utilizan columnas rellenas con resinas de intercambio iónico para separar y determinar iones.

4. Cromatografía de exclusión por tamaño.
La fase fija está formada por partículas poliméricas o de sílice que contienen una red uniforme de poros y llevan a cabo un fraccionamiento realcionado con el tamaño  molecular.

Las moléculas de tamaño mayor son excluídas y eluyen primero, mientras que las más pequeñas que penetran en los poros son retenidas más tiempo.

El HPLC es una de las técnicas de laboratorio más utilizada como herramienta analítica para separar y detectar compuestos químicos.

Una parte fundamental de los cromatógrafos de HPLC es la bomba.

Las bombas para HPLC deben cumplir ciertos requisitos fundamentales:
- Deben producir presiones estables hasta 6000 psi.
- Deben mantener el flujo libre de pulsaciones
- Deben generar intervalos de caudales de flujo (0,1 a 10 ml/min)
- Deben permitir un control y reproducibilidad del flujo de solvente
- Sus componentes deben ser resistentes a la corrosión

Las bombas que se usan en HPLC se pueden clasificar según su funcionamiento y diseño en:

InTechMex – Instrumental Technologies de México ofrece cromatógrafos HPLC y todos sus aditamentos como bombas, splitters, mezcladoras, reactores post-columna, filtros, uniones y todo lo que usted pueda requerir para la operación de su cromatógrafo.

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Características de los métodos cromatográficos

La característica que distingue a la cromatografía de la mayoría de los métodos físicos y químicos de separación, es que se ponen en contacto dos fases mutuamente inmiscibles. Una fase es estacionaria y la otra móvil. Una muestra que se introduce en la fase móvil es transportada a lo largo de la columna (colector) que contiene una fase estacionaria distribuida. Las especies de la muestra experimentan interacciones repetidas (repartos) entre la fase móvil y la fase estacionaria. Cuando ambas fases se han escogido en forma apropiada los componentes de la muestra se separan gradualmente en bandas en la fase móvil. Al final del proceso los componentes separados emergen en orden creciente en interacción con la fase estacionaria. El componente menos retardado emerge primero, el retenido más fuertemente eluye al último.

La fase móvil puede ser un gas o un líquido, mientras que la fase estacionaria sólo puede ser un líquido o un sólido, como se muestra a continuación:

Cromatografía

Cuando la separación involucra predominantemente un reparto simple entre dos fases líquidas inmiscibles, una estacionaria y la otra móvil, el proceso se llama cromatografía líquido-líquido (LCC) . Cuando en la aptitud retentiva de la fase estacionaria intervienen principalmente fuerzas físicas de superficie, el proceso se denomina cromatografía líquido-sólido ( LSC, por sus siglas en inglés).

Otros dos métodos de cromatografía líquida difieren un poco en su modo de acción. En cromatografía de intercambio iónico ( IEC , por sus siglas en inglés), los componentes iónicos de la muestra se separan por el intercambio selectivo con contraiones de la fase estacionaria. En cromatografía de exclusión ( EC , de exclusión cromatography), la fase estacionaria proporciona una clasificación de moléculas basadas en su mayor parte en la geometría y el tamaño molecular. Este método también se llama cromatografía de permeación en gel, en la química de los polímeros y de filtración en gel, en la bioquímica.

Cuando la fase móvil es un gas, los métodos se llaman cromatografía gas-líquido (GLC) y cromatografía gas-sólido (GSC) .

InTechMex (ITM), es una empresa que abastece equipos de laboratorio, accesorios y reactivos a laboratorios de investigación, industriales, clínicos, educativos, y de gobierno. Contando con una amplia gama de equipos para cromatografía y sus diversas modalidades.

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Nuevos equipos para Cromatografía Líquida/Espectrometría de Masa de Agilent Technologies

La cromatografía es una tecnología de medición utilizada para separar, identificar, cuantificar y purificar compuestos. Más de 250 mil clientes en el mundo la utilizan en diversas aplicaciones como pruebas ambientales, de alimentos, estudios forenses, investigación de enfermedades, descubrimiento de medicamentos, seguridad nacional y la industria petroquímica entre otros.

Recientes innovaciones en la materia, fueron anunciadas en días pasados por la empresa Agilent Technologies, Inc., empresa líder en medición electrónica, biociencia y análisis químico. Presente en 110 países en el mundo, con 20 mil empleados, su presencia mundial es una de sus mejores ventajas competitivas, lo cual se refleja en sus capacidades de fabricación, I&D, ventas y soporte técnico.

HPLC-Chip, separaciones de nanoflujo sencillas y reproducibles

La revolucionaria tecnología HPLC-Chip de Agilent, integra de forma transparente las columnas de enriquecimiento de la muestra y separación del sistema LC de nanoflujo, con las intrincadas conexiones y puntas de spray utilizadas en la espectrometría de masas con electrospray. El resultado es un chip de poliamida monolítico del tamaño de una placa de microscopio, que proporciona separaciones de nanoflujo superiores sin los transtornos de las soluciones de LC de nanoflujo convencionales. La interfase HPLC-Chip Cube MS automatiza completamente la manipulación del chip, su colocación y las conexiones para garantizar el máximo rendimiento con el mínimo esfuerzo.

Espectrómetro de Masas/Cromatógrafo Líquido Ion Trap 6340 (LC/MS)

Nuevo sistema acoplado de cromatografía de líquidos y espectrometría de masas: Espectrómetro de Masas/Cromatógrafo Líquido Ion Trap 6340 (LC/MS), que permite a los científicos estudiar las proteínas con mayor detalle. Anteriormente esta metodología era posible con instrumentos cuatro veces más caros y con un operador altamente especializado. El 6340, nuevo instrumento de la serie 6000 de los sistemas LC/MS de Agilent, es un equipo de alta generación y está equipado con una unidad de disociación por transferencia de electrones (ETD), nueva herramienta para el estudio de proteínas y modificaciones post-traslacionales en las mismas.

A diferencia de los instrumentos FT-MS (Espectrómetro de Masas por Transformada de Fourier), el 6340 soporta cromatografía ultra-rápida en escala de nanoflujo, facilitando los estudios proteínicos incluyendo todas las proteínas extraídas de células lisas. Cuando se usan en combinación con el revolucionario HPLC-Chip, el 6340 da a los investigadores la capacidad de identificar y caracterizar modificaciones de proteínas en muestras extremadamente complejas.

Cromatografo de Líquidos modelo 1200

El sistema LC (Cromatografía de Líquidos) serie 1200 de Agilent, reemplaza al LC serie 1100, líder en el mercado. La LC, usada por mpas de 250,000 clientes es todo el mundo para aplicaciones que van desde la ciencia forense hasta la investigación en alimentos, farmacéutica y proteínas, es una tecnología de medición que se emplea para separar, identificar, cuantificar y purificar compuestos. Los clientes pueden combinar módulos nuevos y anteriores, además de seguir usando sus métodos actuales, sin necesidad de desarrollar otros nuevos y más costosos, revalidar o volver a capacitar a los operadores.

El 1200 de Agilent es el sistemas más completo de LC disponible. Con más de 60 módulos de instrumentos, se puede configurar para las principales aplicaciones de la LC, incluyendo un nuevo formato de rápida resolución, así como balanza para preparaciones, flujo estándar, angosto, capilar, nanoflujo y la revolucionaria cromatografía de líquidos con chip de Agilent. Ahora, los Chips HPLC están disponibles para aplicar esta tecnología para moléculas grandes y pequeñas, con separación cromatográfica o sólo para infusión de muestras. La tecnología HPLC-Chip/MS de nanorocío puede brindar a los clientes con mejoras de mapas de 1000 veces en la sensibilidad comparado con la LC/MS convencional.

Sistemas LC/MS serie 6000

Durante el 2006, Agilent, añadirá cinco nuevos instrumentos a esta línea: los espectómetros de masa TOF, Quad único y de trampa de iones se unirán a los sistemas Triple Quadrupolo y Q-TOF de Agilent.

Agilent ofrece una línea completa de Ion Traps, cromatógrafo de líquidos modelo 1200, HPLC-Chip y sistemas LC/MS serie 6000, adecuados para diferentes necesidades de evaluación y desempeño. Para saber más haga click aquí.

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