Los procesos de centrifugado
Existen dos métodos de separación en centrifugación:
A.- Centrifugación diferencial.
B.- Centrifugación en gradiente de densidad.
Coeficiente de sedimentación (s)
La velocidad de sedimentación de una partícula depende del campo centrífugo aplicado. Es un parámetro útil para caracterizar una partícula y puede ser determinada en una ultracentrífuga.
Se define coeficiente de sedimentación (s) como la velocidad de sedimentación por unidad de fuerza centrífuga. Ésta depende de la masa y densidad de la partícula; de la densidad del medio y del coeficiente de fricción, que depende a su vez de la forma de la partícula. El coeficiente de sedimentación(s) es directamente proporcional a la masa de la partícula (m) e inversamente proporcional al coeficiente de fricción (f) de la misma.
S α m/f
La unidad se denomina Svedberg, (S)
1 S= 10-13 seg., en H2O a 20 ºC
La centrifugación diferencial
En este método, el tubo de centrífuga se llena con una mezcla uniforme problema. Tras la centrifugación se obtienen dos fracciones: un pellet que contiene el material sedimentado y un sobrenadante con el material no sedimentado. Es una técnica muy útil, sobre todo para aislamiento de células y orgánulos subcelulares. Es un tipo de separación logrado en base al tamaño de las partículas.
Esta técnica consiste en someter a una muestra heterogénea de partículas a fuerzas de centrifugación crecientes por períodos de tiempo crecientes. Los precipitados obtenidos luego de cada centrifugación estarán enriquecidos en una determinada partícula.
Para lograr la separación, los coeficientes de sedimentación de las partículas deben diferir en al menos un factor de tres (moléculas con s mayores precipitan primero).
La centrifugación en gradiente de densidad
El método de gradiente de densidad implica la utilización de un soporte fluido, cuya densidad aumenta desde la zona superior a la inferior. El gradiente se consigue con un soluto preferiblemente de baja masa molecular en un solvente en el que la muestra a analizar pueda ser suspendida. La muestra se sitúa en la parte superior del gradiente como una fina banda. La separación de los componentes de la muestra se presenta como diferentes bandas o zonas. Existen dos variaciones dentro de la centrifugación en gradiente de densidad:
- Centrifugación de equilibrio en gradiente o isopícnica
- Centrifugación zonal
Estas técnicas permiten la separación de partículas y moléculas que difieren en masa o densidad.
La centrifugación de equilibrio en gradiente o isopícnica
La centrifugación de equilibrio en gradiente separa las partículas con base en sus densidades diferentes. En esta técnica la muestra es disuelta en una solución isocrática y bajo la fuerza centrífuga el soluto forma el gradiente al distribuirse en el tubo durante la centrifugación, se denominan autoformados. La condición fundamental es que la densidad máxima del gradiente final debe siempre exceder a la densidad de las partículas. La centrifugación de equilibrio en gradiente permite que las especies sedimentantes se muevan por el gradiente hasta que alcanzan un punto donde su densidad y la del gradiente son idénticas, por lo cual también se le llama centrifugación isopícnica. En este punto no se producirá una sedimentación posterior debido a que flotan sobre un "colchón" de material que posee una densidad superior que la suya propia de tal manera que aunque se prolongue el tiempo de centrifugación, las partículas no van a ir al fondo del tubo. La densidad de la partícula en ese punto se conoce como “buoyant density”. Esta técnica se emplea para separar partículas similares en tamaño pero distintas en densidad. Esto es cierto para moléculas, tales como ácidos nucleícos, así como diferentes orgánulos celulares.
Se requieren las siguientes características en los solutos usados para formar el gradiente: bajo PM (de manera que el tiempo requerido para lograr el equilibrio sea corto), bajo grado de ionización, baja viscosidad y alta densidad, transparencia a la luz UV, y ser buen solvente para las moléculas que se intentan resolver. Frecuentemente se usa CsCl, el Cs+, por ser un ión compacto, sedimenta lentamente en los altos campos gravitacionales aplicados durante la centrifugación y se establece un gradiente con la mayor concentración en el fondo del tubo (el ión Cl- lo sigue de manera de mantener la neutralidad de las cargas). Por otro lado el Cs+ se une a los fosfatos del DNA y RNA y a los grupos OH- de las ribosas de manera que la densidad de las moléculas de RNA se incrementa más que la del DNA. La densidad aproximada en CsCl de proteínas es 1.3 g/ml; del DNA 1.6 - 1.7 g/ml y del RNA es 1.75 - 1.85 g/ml. Los gradientes de CsCl permiten separar moléculas cuyas densidades difieren en por lo menos 0.02 g/ml.
En los medios de separación suelen incluirse también Hg++ o Ag+, con el propósito de aumentar las diferencias entre las densidades de las moléculas (a pH neutro el Hg++ se une a T y A, y el ión Ag+ se une a G y C). El agregado de compuestos intercalantes como el bromuro de etidio permiten separar moléculas de DNA de distinta conformación aunque tengan la misma composición de bases.
Moléculas con una alta proporción de G y C poseen mayor densidad como consecuencia de los tres puentes H formados.
La siguiente ecuación relaciona el % de G+C con la densidad (?) de la molécula:
% (G+C)= [(?- 1.66)/0.098] 100
La centrifugación zonal
La muestra a analizar se deposita en la parte superior de un gradiente de densidad preformado. Bajo fuerza centrífuga las partículas comenzarán a sedimentar a través del gradiente, moviéndose cada partícula a diferentes velocidades dependiendo de su masa. La migración depende de: el tamaño y forma de las partículas, la fuerza centrífuga aplicada, y la densidad y viscosidad del medio. La propiedad física sobre la que se fundamenta la separación es la masa de las partículas, y no su densidad. A diferencia de lo que ocurre en la centrifugación isopícnica, la densidad máxima del gradiente no debe exceder la de las partículas a separar. Los gradientes de densidad impiden que las bandas de cada componente se ensanchen por efecto de corrientes convectivas y se mezclen durante la aceleración y desaceleración del rotor. Frecuentemente se usan con este propósito gradientes de sacarosa, más densos en el fondo que en la parte superior del tubo; otros medios usados con este fin son: glicerol, Ficoll, Percoll. En general se usan rotores de tipo swing-out. Las muestras son centrifugadas lo suficiente como para separar las moléculas de interés; si la centrifugación se prolonga en el tiempo las partículas se recuperan en el pellet, como se muestra en el siguiente gráfico:
Diagrama de representación de la velocidad de la centrifugación zonal e isopicnica
ρ1: Densidad boyante de partículas de menos densidad
ρ2: Densidad boyante de partículas de más densidad
Con la finalidad de obtener separaciones adecuadas de los componentes de las mezclas es necesario que la velocidad y el tiempo de centrifugado sea el adecuado para lo cual el equipo en el cual se llevará a cabo el proceso deberá estar debidamente calibrado, en cuanto a revoluciones por minuto y a tiempo de centrifugado, para lo cual Instrumentos Científicos y de Laboratorio (ICLAB), cuenta con personal calificado para verificar y calibrar este tipo de equipos
Instrumentos Científicos y de Laboratorio S. A. de C. V., (ICLAB), es una empresa con la misión de proporcionar servicios de calibración y calificación de la más alta calidad a equipos e instrumentos, cumpliendo con los requerimientos de normas y recomendaciones nacionales e internacionales.
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