Pirógenos y purificación de agua

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Agua

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Los pirógenos

El descubrimiento de que la inyección de soluciones acuosas a un paciente podía causar fiebre data de 1876.

Los agentes responsables de este incremento en la temperatura fueron llamados "pirógenos". Más adelante se descubrió que varias sustancias presentes en el agua podían causar efectos pirogénicos.

Los pirógenos más comunes son las endotoxinas (ET), por ejemplo los lipo-poliscáridos (LPS), que provienen de fragmentos de la pared celular de bacterias Gram-negativas.

Efectos fisiológicos de los pirógenos

Se ha observado cierta diversidad de efectos, así como una dependencia de los mismos a la dosis administrada.

En general, los pirógenos elevan los niveles de citosinas inflamatorias circulantes, seguido de eventos clínicamente relevantes como fiebre, hipotensión, linfopenia, neutrofilia, niveles elevados de cortisol de plasma y proteínas de fase aguda.

Bajas dosis de pirógenos inducen reacciones inflamatorias, sin síntomas clínicamente significativos. Dosis moderadas de pirógenos inducen fiebre y cambios significativos en la composición del plasma.

La administración de altas dosis de pirógenos puede llevar a choques sépticos, caracterizados por una disfunción cardiovascular, incluyendo la depresión y dilatación del miocardio, la vasodilatación, vasoconstricción, disfunción del endotelio y disfunción de órganos (riñón, hígado, pulmones y cerebro), seguido de la falla de múltiples órganos y muerte.

Las células endoteliales juegan un rol muy importante en la regulación de la hemostasis, manteniendo una barrera antitrombótica. El daño celular de las células del endotelio debido a endotoxinas es una implicación de la patogénesis de los choques sépticos, dado que estas células cambian como respuesta al estímulo pirogénico y desarrollan propiedades protrombóticas (alterando la regulación de la trombomodulina, la adherencia de leucocitos y la proliferación y reparación de si mismas, entre otras funciones importantes). La información disponible sugiere que los LPS causan daños irreversibles al endotelio.

Adicionalmente, la introducción intravenosa de LPS en humanos sanos suprimió la respuesta de la citosina en ciertos experimentos in vitro que confirmaron que la síntesis reducida de citosina no fue debida a la tolerancia de la ET, sino a una verdadera reacción de supresión inmunológica.

Pirógenos y aplicaciones de laboratorio

En vista de que los niveles de pirógenos en agua pueden variar dramáticamente y de que su presencia puede afectar los resultados de experimentos bioquímicos y biológicos (además de los mencionados efectos en pacientes), se han establecido niveles máximos aceptables para contaminantes pirogénicos en agua de laboratorio, en estándares ASTM relativos a agua purificada para aplicaciones de laboratorio.

En algunos casos, incluso niveles pequeños de pirógenos pueden alterar dramáticamente los resultados de pruebas biológicas. Este impacto negativo de los pirógenos en agua ha sido demostrado en varios experimentos científicos:

Cultivo de células de mamíferos:  

Debido a su naturaleza, las endotoxinas interactúan con las membranas celulares y tienen efectos mayúsculos en las funciones y crecimiento celular. Estos efectos pueden ser causados por la inserción de LPS en la membrana celular, su adhesión a receptores celulares o a proteínas solubles. Ha sido demostrado que el uso de agua libre de pirógenos en los medios para cultivo celular optimiza la viabilidad celular y su crecimiento.

Fertilización in vitro: 

El uso de agua ultrapura, libre de pirógenos en la preparación de medios y buffers conlleva un mejor desarrollo del embrión y mayores tasas de fertilización.

Electroforesis: 

El agua utilizada para la preparación de reactivos y el enjuague del equipo debe estar libre de pirógenos y otras sustancias orgánicas que podrían afectar adversamente la polimerización de geles o bien, la precisión del enfoque isoeléctrico, con lo que pondrían en riesgo la precisión y reproducibilidad de resultados experimientales

Biología molecular: 

Técnicas experimentales sensibles como la PCR, clonación o producción de anticuerpos monoclonales, requieren del uso de agua ultrapura y libre de contaminantes inorgánicos y orgánicos (como pirógenos y ácidos nucléicos).